Ministerio de Salud de la Nación
Secretaría de Políticas, Regulación e Institutos
ADMINISTRACIÓN NACIONAL DE LABORATORIOS E INSTITUTOS DE SALUD “DR. CARLOS G. MALBRAN”
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Agudas
DEPARTAMENTO VIROLOGÍA
Buenos Aires- ARGENTINA

INFORME Y CONCLUSIONES
El “I taller sobre la infección del virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes trasplantados” organizado por el Servicio Virus Oncogénicos, Laboratorio Nacional de Referencia de EBV (LNR), INEI-ANLIS “Carlos G. Malbrán” se desarrolló el miércoles 10 de octubre en el predio central de la ANLIS.
Asistieron integrantes del Servicio Virus Oncogénicos, del Equipo Operativo – Gestión de Calidad (INEI) y 30 profesionales provenientes de: la Ciudad Autónoma de Bs. As.: Hospital de Pediatría SAMIC “Prof. Dr. Juan P. Garrahan”, Hospital Italiano de Bs As, Laboratorios Stamboulián, CEMIC, Hospital Alemán – Laboratorio Domecq&Lafage, Hospital General de Niños “Dr Pedro de Elizalde”, Hospital General de Agudos “Dr C. Argerich”, Hospital de Infecciosas “Francisco J. Muñiz”, Diagnóstico Bioquímico y Genómico Manlab, Fundación Favaloro, Hospital General de Agudos “Carlos G. Durand”; de la Pcia de Bs. As: Hospital General de Agudos “Dr R. Rossi” (La Plata), Hospital El Cruce SAMIC (Florencio Varela), Hospital Nacional “Prof. Alejandro Posadas” (El Palomar), Hospital de Niños “Sor María Ludovico” (La Plata); IACA – Laboratorios Análisis Alta Complejidad (Bahía Blanca); de la Pcia. de Santa Fe: Laboratorio CIBIC – Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad (Rosario); de la Pcia. de Córdoba: Laboratorio Central de Córdoba y Hospital Privado – Centro Médico Córdoba; de la Pcia. de Mendoza: Hospital Italiano de Mendoza.
Fueron invitados, pero no asistieron los representantes del Hospital Gutiérrez (CABA), Hospital Austral (Pilar, Pcia. de Bs. As.) y Hospital Central de Mendoza (Pcia. de Mendoza)
Durante el taller se expusieron las experiencias en el estudio de la infección por EBV en pacientes trasplantados del Laboratorio anfitrión y de los distintos centros invitados.

Las principales conclusiones fueron:

1- Detección cualitativa de ADN de EBV: algunos participantes mencionaron el uso de métodos de PCR convencional (artesanales) y de PCR en tiempo real (comerciales) sobre muestras de sangre entera, líquido cefalorraquídeo (LCR) y biopsias de tejido. Se comentó la necesidad de establecer e indicar al médico tratante la utilidad clínica del estudio:
– Estado de infección (sangre periférica): Con el objeto de aplicar este método para estudiar el estado de infección, se propuso conocer la carga de EBV en sangre periférica de portadores sanos y de esta manera estandarizar un ensayo con una sensibilidad adecuada a los fines clínicos.
– Asociación de infección a patología (LCR y tejidos): Se remarcó que la metodología de referencia para establecer asociación de una patología con el EBV en tejidos es la hibridación in situ para los transcriptos EBERs. Se cuestionó el valor de establecer esta asociación realizando una PCR cualitativa sobre una muestra de tejido debido a que la variedad de métodos empleados no han sido evaluados para tal fin; aunque se sugirió considerar su valor predictivo negativo.
Se señaló la necesidad de profundizar aspectos relacionados a la detección cualitativa de ADN viral.

2- Diversidad de métodos de cuantificación: Se describieron métodos de cuantificación de ADN de EBV que utilizan PCR convencional, PCR en tiempo real, ensayos comerciales, artesanales. La mayor parte de los ensayos descriptos se basan en PCR en tiempo real, siendo la mayoría de tipo comercial (8 laboratorios emplean el Light Cycler EBV Quantification Kit, Roche; 2 laboratorios, EBV Q-PCR Alert kit, Nanogen) y algunos de tipo artesanal (3 laboratorios). Entre estos últimos, el LNR describió el desarrollo y validación de un método de PCR en tiempo real artesanal. Un laboratorio refirió el uso de un método de PCR convencional (método semicuantitativo por dilución límite).

3- Diversidad de controles para estandarizar los ensayos: se informó el uso de ADN proveniente de líneas celulares infectadas con EBV, plásmidos con fragmentos de genoma viral insertado, ADN de EBV de origen comercial. Se comunicó la disponibilidad a partir del corriente año de un estándar internacional de la Organización Mundial de la Salud para EBV para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (http://www.nibsc.ac.uk/documents/ifu/09-260.pdf). El LNR anunció que inició la gestión para su adquisición.

4- Diversidad de muestras clinicas: se describió el uso de una variedad de muestras clínicas sobre las que se aplican los ensayos de cuantificación de EBV: sangre entera, plasma, células mononucleares periféricas. La mayoría de los laboratorios cuantifican ADN de EBV exclusivamente en muestras de plasma, empleando el método de Roche y un método artesanal. Los laboratorios que cuantifican EBV a partir de muestras de sangre entera utilizan el método de Nanogen. Un laboratorio informó que se halla en etapa de evaluación de la estrategia metodológica a aplicar y analiza en forma paralela muestras de sangre entera y plasma con el ensayo de Roche. El LNR propone utilizar ADN obtenido de células mononucleares periféricas y de plasma en forma conjunta, basado en la validación clínica realizada con un método de PCR en tiempo real artesanal.

5) Diversidad de métodos de extracción de ADN y cantidad de templado empleado en la cuantificación: se describió la aplicación de métodos de extracción de ADN de tipo comercial, la mayoría automatizados (Magna Pure, Roche), semi automatizados (QIamp DNA Mini kit, QIAGen y QIACub) y manuales por columnas (Invitrogen, High Pure Viral Nucleic Acid Kit – Roche, Qiamp DNA Mini Kit – QIAGen). También se refirió la aplicación de un método artesanal empleando proteinasa K y fenol-cloroformo.
La cantidad de ADN templado cuantificado con los diversos ensayos representa entre 10 y 50 µl de plasma, 5 y 10 µl de sangre entera y al menos 100.000 células mononucleares periféricas.

6- Diversidad de formas de expresar los resultados: de acuerdo a las diferentes estrategias metodológicas aplicadas, los resultados se informan como copias de ADN de EBV por ml de plasma, por ml de sangre entera y por 100.000 células mononucleares periféricas.

7- Requerimientos de validación / verificación de ensayos: Todo ensayo desarrollado/modificado por el laboratorio (“in house” o artesanal) debe ser validado analíticamente para conocer las características de su desempeño (“performance”) y validado clínicamente para determinar su forma de aplicación en la población a estudiar. La validación de métodos artesanales requiere un mayor numero de materiales de control, repeticiones y días para establecer los parámetros de desempeño, que los que se utilizan en la verificación de los métodos comerciales, que ya fueron validados por el fabricante. Todo ensayo comercial debe ser verificado antes de ser empleado en la rutina para emitir resultados de diagnóstico.
Asimismo, los parámetros de desempeño de un ensayo se verifican cada vez que se corre un ensayo y también cuando se cambian alguna condición crítica (lotes de reactivos, descalibración de equipamiento, etc).
En el marco del aseguramiento de calidad de los resultados de diagnóstico y para evaluar en forma continua el desempeño del método es muy importante verificar la precisión con 2 niveles de concentración como mínimo y construir cartas de control diarias para detectar errores y permitir su corrección.
En las presentaciones, en general, sólo se mostraron las formas de verificación diaria del desempeño de los ensayos, las cuales resultaron muy variadas. Además, se observó que pocos laboratorios registran de manera continua el desempeño de sus ensayos.
Por lo tanto, dada la amplia diversidad de situaciones observadas entre los laboratorios participantes se señaló la necesidad de profundizar en estos aspectos.

8- Imposibilidad de comparar los resultados entre distintos laboratorios: esto quedó demostrado dada la amplia variedad de estrategias metodológicas aplicadas en relación a la muestra clínica, métodos de extracción y cuantificación, cantidad de templado cuantificado.

9- Necesidad de comprensión por parte de la comunidad médica de las limitaciones actuales en el uso de la carga de EBV: se observó en general una falta de interacción entre los laboratorios y los equipos médicos en relación a la aplicación de esta herramienta.

10- Todo lo mencionado indica la necesidad de armonizar las estrategias de cuantificación de EBV utilizadas para el seguimiento de los pacientes trasplantados: Dado el escenario descripto, el LNR propuso la realización de un estudio multicéntrico con el objetivo de comparar los métodos de cuantificación de EBV en uso en Argentina. Se invitó a todos los participantes a formar parte del estudio, el cual incluiría:

– La preparación de un panel (alrededor de 12 tubos) incluyendo muestras con diferentes niveles de ADN de EBV (expresados en unidades internacionales, UI) y tipos de matriz.

– La distribución y resolución del panel se realizaría durante 2013. A partir de estos resultados se compararían las distintas estrategias metodológicas.

– La información obtenida en este estudio se compartirá y discutirá con el grupo; estos resultados se presentarán en reuniones científicas y se publicarán con la co-autoría de todos los participantes.

11- Aplicación clinica de la carga de EBV: Se planteó que una vez resueltos los aspectos analíticos en relación a las estrategias metodológicas aplicadas al estudio de carga de EBV, en una segunda etapa se iniciará la discusión sobre su aplicación clínica en el seguimiento de los pacientes trasplantados. Para ello, además de los profesionales de laboratorio, se invitará a participar a la comunidad médica vinculada al tema.